میکروسکوپ فلورسانس

میکروسکوپ فلورسانس شکل خاصی از میکروسکوپ نوری است . این بر اساس اثر فیزیکی فلورسانس است . هنگامی که مواد فلورسنت با نوری با طول موج های خاص برانگیخته می شوند ، نوری با طول موج های طولانی تر ساطع می کنند ( Stokes Shift ).

در میکروسکوپ فلورسانس، تصویر تولید شده و بزرگ شده از جسم مورد بررسی تنها توسط نور تابیده شده (گسیل شده) تولید می شود. فیلترهای رنگی از ورود نور تحریک به تصویر جلوگیری می کنند. تصاویر میکروسکوپی فلورسانس زمانی آموزنده هستند که کل آماده سازی میکروسکوپی به طور یکنواخت فلورسانس نمی شود، اما فقط برخی از ساختارها روشن می شوند. این ساختارها سیگنال های روشنی را در پس زمینه تاریک تولید می کنند.

هر مولکول فلورسنت در آماده سازی را می توان به عنوان یک منبع نور جدید مشاهده کرد. اگر شدت فلورسانس ساطع شده توسط این مولکول ها بالاتر از حد تشخیص باشد، میکروسکوپ فلورسانس می تواند ساختارهایی را که به مراتب کوچکتر از حد تفکیک میکروسکوپ هستند را نیز تشخیص دهد. با این حال، محدودیت وضوح در میکروسکوپ فلورسانس کلاسیک غلبه نمی‌کند، زیرا تشخیص در فاصله‌ای کوچک امکان‌پذیر است، اما نمی‌توان اظهارنظری درباره اینکه آیا سیگنال توسط یک یا چند ساختار ایجاد می‌شود یا خیر. از این نظر مشابه میکروسکوپ میدان تاریک است .

علاوه بر کلاسیک، چندین اشکال خاص بیشتر از میکروسکوپ فلورسانس وجود دارد. برای مثال، میکروسکوپ اسکن لیزری کانفوکال و میکروسکوپ فلورسانس چند فوتونی از جمله این موارد است . از دهه 1990، روش های مختلفی توسعه یافتند که در واقع وضوح قابل توجهی را بهبود می بخشند. این روش‌های به اصطلاح با وضوح فوق‌العاده یا با وضوح فوق‌العاده نیز از نوع میکروسکوپ فلورسانس هستند.

فهرست میکروسکوپ فلورسانس

مبانی

فلورسانس

یک مولکول فلورسنت دارای یک الکترون است که می تواند با جذب فوتون از حالت پایه کم انرژی (S 0 ) به حالت برانگیخته با انرژی بالاتر ( S 1 ) تبدیل شود. هر دو S 0 و S 1 دارای چندین حالت فرعی هستند که هر کدام در محتوای انرژی ارتعاشی (همچنین: انرژی ارتعاشی) الکترون متفاوت است. تفاوت انرژی بین حالت ارتعاشی اولیه در S 0 و حالت ارتعاشی بدست آمده در S 1 دقیقاً با محتوای انرژی فوتون جذب شده مطابقت دارد.

وقتی الکترون به حالت پایه برمی گردد، فوتون ساطع می شود. این انتشار نور چند نانوثانیه پس از جذب رخ می دهد – این همان فلورسانس است. برای به وجود آمدن آن، باید تفاوت واضحی در محتوای انرژی بین S 0 و S 1 وجود داشته باشد و نباید سطوح انرژی دیگری در این بین وجود داشته باشد، در غیر این صورت الکترون های برانگیخته از طریق فرآیندهای غیر تشعشعی به حالت پایه باز می گردند. [2]

از آنجایی که هر دو حالت پایه S 0 و حالت برانگیخته S 1 دارای چندین حالت فرعی هستند، نه تنها فوتون هایی با محتوای انرژی دقیقاً معین می توانند جذب یا گسیل شوند، بلکه فوتون هایی با محتوای انرژی مشابه نیز قابل جذب هستند. از آنجایی که محتوای انرژی یک فوتون با طول موج آن نسبت معکوس دارد ، به این معنی است که یک فلورسر توسط تعدادی طول موج مشابه برانگیخته می شود: به این طیف تحریک می گویند . به همین ترتیب، برخی از طول موج های مشابه، طیف گسیلی را منتشر می کند . [2]

فلورسانس همیشه از پایین ترین سطح انرژی برانگیخته ساطع می شود ( قانون کاشا ). اگر الکترون با جذب فوتون برانگیخته به حالت برانگیختگی بالاتر برود، ابتدا از طریق آزاد شدن انرژی غیر تابشی قبل از گسیل شدن فوتون به کمترین سطح انرژی برانگیخته می رسد. این چندین پیامد مهم برای میکروسکوپ فلورسانس دارد: [2]

به طور متوسط، فوتون های ساطع شده انرژی کمتری دارند و بنابراین به سمت انتهای قرمز طیف نور منتقل می شوند . این اثر تغییر استوکس نامیده می شود . تفاوت در انرژی به عنوان انرژی ارتعاشی ، یعنی گرما در آماده سازی باقی می ماند. توزیع طیفی نور فلورسانس ساطع شده مستقل از طول موج نور تحریک است. زمان از جذب تا رسیدن به پایین ترین حالت برانگیختگی تا گسیل فوتون دارای توزیع مشخصه ای برای فلورسر است. طول عمر فلورسانس نامیده می شود و اساس میکروسکوپ طول عمر فلورسانس است .

به موادی که فلورسانس می کنند فلوروفور می گویند. فلوروفورهایی که برای رنگ آمیزی نمونه ها استفاده می شوند، رنگ های فلورسنت یا فلوروکروم نامیده می شوند.

اتوفلورسانس و فلوروکروم

هنگامی که یک نمونه به خودی خود فلورسانس می شود، به آن فلورسانس خودکار، فلورسانس ذاتی یا فلورسانس اولیه گفته می شود. بسیاری از گیاهان در قسمت‌های مختلف خود فلورسانس بسیار قوی دارند، برای مثال گیاهان دانه در قسمت‌های چوبی ساقه‌هایشان . کلروفیل موجود در کلروپلاست سلول های سبز گیاهی به شدت به رنگ قرمز فلورسانس می شود. در مقایسه، سلول‌های حیوانی فقط به‌طور ضعیف فلورسانس می‌کنند، اما همچنان به‌قدری قوی هستند که تحت شرایط خاص علائم فلورسنت را پنهان می‌کنند. منابع اصلی در اینجا فلاوین ها هستند که در میتوکندری و لیپوفوسین درلیزوزوم ها . [3] کوآنزیم NADPH نیز اتوفلورسانس را نشان می دهد.

فلورسانس که به طور مصنوعی در یک آماده سازی حاوی فلوروکروم ایجاد می شود، فلورسانس ثانویه است. فرآیندی که منجر به این می شود برچسب زدن فلورسنت نامیده می شود . فلوئوروکروم‌های خوب چندین ویژگی را با هم ترکیب می‌کنند: (1) آنها احتمال بالایی برای جذب فوتون دارند، به این معنی که ضریب جذب بالایی دارند . (2) بیشتر فوتون های جذب شده در واقع منجر به گسیل یک فوتون فلورسانس می شوند ( بازده کوانتومی بالا ). هر دو با هم به یک روشنایی عالی منجر می شوند. (3) فلوروکروم ها باید سفید کنندگی کمی از خود نشان دهند ، به این معنی که اغلب می توانند بدون از بین رفتن برانگیخته شوند. (4) علاوه بر این، فلوئوروکروم ها باید تا حد امکان در ناحیه باریکی از طیف نور باشند.فلورسانس به طوری که تا آنجا که ممکن است بسیاری از فلوئوروکروم ها با رنگ های فلورسنت مختلف می توانند به طور همزمان برای رنگ آمیزی ساختارهای مختلف استفاده شوند.

کانال های رنگی

اگر طیف تحریک و انتشار دو فلوروکروم به طور قابل توجهی همپوشانی داشته باشند، نمی توان آنها را از یکدیگر متمایز کرد. به عنوان مثال، فلورسئین ، پروتئین فلورسنت سبز داشته باشیدSpectrum Green و تعدادی دیگر از رنگ های موجود در بازار دارای طیف های بسیار مشابهی هستند به طوری که نمی توان آنها را با رنگ فلورسنت تشخیص داد. اگر قرار است از رنگ های فلورسنت مختلف در کنار یکدیگر برای رنگ آمیزی ساختارهای مختلف استفاده شود، این رنگ ها باید طیف های متفاوتی داشته باشند. به طور معمول، نور ماوراء بنفش فلوروکروم‌های فلورسنت آبی را تحریک می‌کند، نور آبی فلوروکروم‌های سبز را تحریک می‌کند و نور سبز فلوروکروم‌های قرمز را تحریک می‌کند. بنابراین می توان از این سه کانال رنگی برای نمایش ساختارهای مختلف در یک آماده سازی استفاده کرد.

با این حال، این تعداد رنگ هایی را که می توان همزمان تشخیص داد، تمام نمی کند. هشت فلوئوروکروم مختلف قبلاً به صورت موازی استفاده شده است. برای این منظور، DAPI به عنوان یک ضد رنگ فلورسنت آبی برای DNA و هفت رنگ دیگر همراه با پروب های ژن برای هیبریداسیون فلورسانس درجا استفاده شد : دی اتیل آمینوکومارین (Deac)، طیف گرین و رنگ های سیانین Cy3، Cy3.5، Cy5، Cy5.5. و Cy7. [5] [6] بیشتر میکروسکوپ های فلورسانس دارای سه تا پنج کانال رنگی هستند.

ساخت میکروسکوپ های فلورسانس

در میکروسکوپ نوری “عادی”، میکروسکوپ میدان روشن نور عبوری ، تصویر توسط نوری که از نمونه می تابد تولید می شود. این مورد در مورد میکروسکوپ فلورسانس نیست. در اینجا تصویر توسط نور فلورسنت تولید می شود که فقط در نمونه ایجاد می شود. نور تحریک که به آماده سازی تابش می کند، توسط فیلترهای مخصوص از تولید تصویر حذف می شود. از آنجایی که نور فلورسنت در شرایط عادی در تمام جهات فضایی به طور یکنواخت منتشر می شود، اساساً مهم نیست که نور تحریک از بالا، پایین یا از طرفین باشد. در واقع، هر سه نوع اجرا شد.

در آغاز میکروسکوپ فلورسانس، در نیمه اول قرن بیستم، میکروسکوپ های فلورسانس نور عبوری ساخته شدند. آنها اکنون فقط مورد توجه تاریخی هستند (به بخش تاریخ در زیر مراجعه کنید). در دسترس بودن آینه‌های دو رنگ (همچنین: تقسیم‌کننده‌های پرتو دو رنگ) از حدود سال 1970 امکان ساخت میکروسکوپ‌های فلورسانس نور بازتابی را فراهم کرد که در آن نور تحریک از طریق شیئی به نمونه تابش می‌شود. آنها همچنین میکروسکوپ اپی فلورسانس نامیده می شوند، پس از یونانی ἐπί برای “روشن”. این نوع ساختمان تقریباً از اواخر قرن بیستم به طور انحصاری مورد استفاده قرار گرفته است. روشنایی جانبی در یک میکروسکوپ فلورسانس تخصصی استفاده می شودمیکروسکوپ ورقه ای نور (به زیر مراجعه کنید).

میکروسکوپ اپی فلورسانس: میکروسکوپ فلورسانس معمولی

در مقایسه با میکروسکوپ‌های میدان روشن با نور عبوری، میکروسکوپ‌های اپی فلورسانس دارای یک محور روشنایی نور فرودی اضافی برای نور تحریک فلورسانس هستند. جسمی که باید مشاهده شود از طریق عدسی روشن می شود. شماره گذاری زیر به ترسیم شماتیک اشاره دارد.

1. یک فیلتر نوری مناسب انتخاب شده ، فیلتر تحریک ، تنها بخشی از نور تولید شده توسط لامپ را که حاوی طول موج های مورد نیاز برای تحریک رنگ فلورسنت است، عبور می دهد. ناحیه ای از طیفی که در آن رنگ فلورسنت می درخشد نباید از فیلتر تحریک عبور کند.
2. یک تقسیم کننده پرتو نور تحریک را به عدسی منعکس می کند، در نتیجه فلورسانس در نمونه رخ می دهد. بنابراین عدسی عملکرد کندانسور را نیز بر عهده می گیرد . فلورسانس طول موج بیشتری نسبت به نور تحریک دارد.
3. بخشی از نور فلورسنت که توسط عدسی جمع آوری می شود به نوبه خود به تقسیم کننده پرتو می رسد. با توجه به خواص ویژه اش، این نور موج بلندتر در جهت چشمی یا آشکارساز عبور می کند (و منعکس نمی شود). از سوی دیگر، نور تحریکی که در نمونه منعکس می‌شود، تا حد زیادی به سمت لامپ هدایت می‌شود.
4. از آنجایی که تقسیم کننده های پرتو به خوبی کار نمی کنند، بخش کوچکی از نور تحریک منعکس شده در نمونه همچنان به چشمی یا آشکارساز می رسد. از آنجایی که شدت فلورسانس در مقایسه با تحریک بسیار ضعیف است، فیلتر نوری دیگری به نام فیلتر رد یا فیلتر انتشار برای حذف این نور تحریک باقیمانده مورد نیاز است.

سه فیلتر ذکر شده اغلب در یک بلوک مشترک در میکروسکوپ های فلورسانس امروزی نصب می شوند. در میکروسکوپ های عمودی، این در محور نوری بالای عدسی قرار دارد. در مورد میکروسکوپ های فلورسانس معکوس، زیر عدسی قرار می گیرد. در دستگاه های با اپتیک بی نهایت، در فضای بینهایت بین شیئی و لنز لوله قرار دارد.

• 

  شماتیک یک میکروسکوپ اپی فلورسانس

• 

  میکروسکوپ اپی فلورسانس عمودی. محفظه مشکی سمت راست حاوی منبع نور برای تحریک فلورسانس است. یک دوربین CCD در محفظه سیاه رنگ بالای میکروسکوپ قرار دارد.

• 

  میکروسکوپ اپی فلورسانس عمودی با پوشش باز که برجک را با مکعب های فیلتر فلورسانس نشان می دهد

• 

  میکروسکوپ اپی فلورسانس معکوس. هدف زیر موقعیت نمونه است و در اینجا قابل مشاهده نیست.

منابع نور

تولید فلورسانس در نمونه فرآیند مؤثری نیست: تنها کسری از نور تحریک توسط رنگ‌های فلورسنت جذب می‌شود. بنابراین، برای اینکه بتوان سیگنال های روشنی را تولید کرد که با چشم قابل مشاهده است، شدت نور بسیار بالایی لازم است.

به طور معمول، میکروسکوپ های فلورسانس مجهز به لامپ های بخار جیوه ، لامپ های متال هالید ، لامپ های تخلیه گاز زنون یا از قرن بیست و یکم، لامپ های LED هستند . بیشتر منابع نور در سراسر طیف مرئی و همچنین در محدوده فرابنفش می درخشند. طول موج های مورد نیاز برای بررسی فلوئوروکروم در هر مورد با استفاده از یک فیلتر مناسب انتخاب می شود و بقیه سرکوب می شوند. [2]

فیلترها

در حالی که در گذشته از فیلترهای رنگی ساخته شده از شیشه های رنگی استفاده می شد، امروزه اغلب از فیلترهای تداخلی استفاده می شود. با این حال، فیلترهای تداخل به طور قابل توجهی گران تر هستند، بنابراین هنوز از شیشه های رنگی استفاده می شود. هر دو نوع را می توان برای فیلترهای تحریک و انتشار استفاده کرد. تقسیم کننده پرتو دو رنگ فقط می تواند به عنوان یک فیلتر تداخل ساخته شود.

فیلترهای تداخلی از یک صفحه شیشه ای تشکیل شده اند که چندین لایه نازک از مواد روی آن اعمال می شود. تداخل بین لایه‌ها اتفاق می‌افتد و به طول موج‌های خاصی اجازه عبور می‌دهد در حالی که بقیه را منعکس می‌کند. برخلاف شیشه های رنگی، نور جذب نمی شود. با انتخاب مواد مناسب و ضخامت لایه ها می توان فیلترهایی برای طول موج های مختلف تولید کرد. نوری که در زوایای مختلف به فیلترهای تداخل برخورد می کند، فواصل مختلفی را در لایه های مربوطه طی می کند. بنابراین، خواص فیلتر بسته به زاویه تابش نور تغییر می کند. بنابراین یک فیلتر تداخل باید در زاویه مورد نظر در میکروسکوپ نصب شود تا به درستی عمل کند.

از نظر عملکرد، بین فیلترهای کوتاه گذر، بلند گذر و باند گذر تفاوت قائل می شود. فیلترهای کوتاه گذر اجازه عبور نور تا یک طول موج مشخص را می دهند. بنابراین یک KP480 نور را تا 480 نانومتر منتقل می کند و نور با طول موج های بلندتر را مسدود می کند. در مقابل، فیلترهای طولانی گذر نور را از خود خارج می کنندیک طول موج مشخص، به عنوان مثال یک نور LP520 با طول موج بیشتر از 520 نانومتر. فیلترهای باند گذر فقط به بخش خاصی از طیف اجازه عبور می دهند. یک فیلتر باند گذر با نام 525/50 به یک پنجره طیفی 50 نانومتری اجازه عبور می دهد که مرکز آن 525 نانومتر است، یعنی پنجره ای 500 تا 550 نانومتری. ویژگی های یک فیلتر معمولاً فقط مربوط به محدوده مرئی است و محدوده های طیفی به طور مستقیم مجاور بنابراین ممکن است، برای مثال، یک فیلتر باند گذر برای محدوده مرئی در مادون قرمز دوباره نفوذپذیر شود. این می تواند منجر به مشکلاتی در تحریک فلورسانس دو فوتون شود (به زیر مراجعه کنید).

خواص طیفی پیچیده تر را نیز می توان با فیلترهای تداخلی درک کرد. به عنوان مثال، یک فیلتر می تواند از چندین پنجره طیفی عبور کند، اما مناطق بین آن را مسدود کند (چند باند). تقسیم‌کننده‌های پرتو دو رنگی، که چندین محدوده طیفی را منعکس می‌کنند و به محدوده‌های میانی اجازه عبور می‌دهند، نیز قابل اجرا هستند (چند دو رنگ). این امکان دیدن چندین کانال فلورسانس را به طور همزمان فراهم می کند. برخی از منابع نور می توانند خیلی سریع بین طول موج های تحریک مختلف جابجا شوند، برای مثال برخی از دستگاه های LED. با استفاده از یک فیلتر چندگانه و چند باند به عنوان فیلتر انتشار، کانال های فلورسانس مختلف را می توان بسیار سریع به صورت متناوب استفاده کرد زیرا هیچ فیلتری نباید جابجا شود.

در میکروسکوپ های اپی فلورسانس، فیلترهای تحریک، تقسیم کننده های پرتو و فیلترهای انتشار معمولاً در بلوک های فیلتر ترکیب می شوند. هر سه فیلتر با هم از یک کانال به کانال دیگر مبادله می شوند، یا با حرکت دادن یک نوار لغزنده حاوی ترکیبات برای سه تا چهار رنگ، یا با چرخاندن چرخی که روی آن چندین مکعب فیلتر برای هر کانال نصب شده است.

در برخی از میکروسکوپ‌های اسکن لیزری که با فلورسانس کار می‌کنند، عملکرد فیلترهای تحریک یا تقسیم‌کننده‌های پرتو با تعدیل‌کننده‌های آکوستو-اپتیکی (AOM، همچنین: فیلتر قابل تنظیم آکوستو-اپتیکال (AOTF) یا تقسیم‌کننده پرتو آکوستو-اپتیکال (AOBS) جایگزین می‌شود. فیلتر انتشار را می توان با جداسازی طیفی نور فلورسنت که در این دستگاه ها فقط از یک نقطه می آید، قبل از تشخیص و سپس تنها قسمت های مورد نظر طیف را تشخیص داد، جایگزین کرد. چنین جدایی با یک منشور یا یک توری پراش حاصل می شود .

آشکارسازها

نمونه هایی با فلورسانس روشن در محدوده قابل مشاهده برای چشم انسان تا طول موج حدود 620 نانومتر را می توان مستقیماً از طریق چشمی مشاهده کرد. از دوربین ها برای مستندسازی استفاده می شود. در حالی که از فیلم های عکاسی اولیه استفاده می شد، در اواخر قرن بیستم تغییر به دوربین های الکترونیکی اتفاق افتاد. اغلب از دوربین های CCD استفاده می شودبرای ثبت تصاویر سیاه و سفید استفاده می شود. از آنجایی که هیچ فیلتر رنگی در دوربین وجود ندارد، همه پیکسل‌ها می‌توانند هر رنگی را ضبط کنند و تصویر روشن‌تر از حالت دوربین‌های رنگی می‌شود. اینکه کدام رنگ واقعاً توسط دوربین گرفته می شود توسط فیلتر انتشار قبلی مشخص می شود. رنگ های فلورسنت با رنگ های مختلف در یک آماده سازی یکی پس از دیگری ضبط می شوند و می توانند روی کامپیوتر قرار گیرند. هر رنگی را می توان به رنگ های مربوطه اختصاص داد، به صورت اختیاری رنگ طبیعی آنها یا رنگ دیگری، به عنوان مثال برای تضاد بهتر رنگ ها.

مشکلات در میکروسکوپ فلورسانس 

محو شدن فلورسانس

مولکول های فلورسنت نمی توانند به طور نامحدود تحریک شوند زیرا می توانند توسط نور تحریک از بین بروند. فرآیندی که به عنوان سفید کننده نور شناخته می شود ، بسته به پایداری نور آماده سازی فلورسنت، سریعتر یا کندتر اتفاق می افتد. پس از آن یک مولکول فلورسنت کم و بیش احتمال محو شدن دارد.

یک مولکول در حالت برانگیخته تنها با فلورسانس نمی تواند به حالت پایه (S 0 ) برگردد. احتمال دوم، تبدیل داخلی است که در آن انرژی در طی انتقال به حالت پایه به گرما تبدیل می شود. مورد سوم محو شدن است که شامل تخریب رنگ از طریق واکنش های فتوشیمیایی است . این واکنش ها به حالت اسپین الکترون ها مربوط می شود.

الکترون‌های یک فلوروکروم معمولاً در حالت منفرد هستند که در آن تمام الکترون‌های مولکول جفت اسپینی هستند . بنابراین، حالت پایه نیز به عنوان S 0 ، حالت برانگیخته “عادی” به عنوان S 1 نامیده می شود (شکل را با نمودار انرژی ببینید). همانطور که در بالا توضیح داده شد ، S 0 و S 1 دارای چندین حالت فرعی هستند که هر کدام از نظر سطح انرژی تفاوت کمی دارند. علاوه بر این، با این حال، حالات برانگیختگی پرانرژی دیگری نیز وجود دارد که از نظر سطح انرژی به طور قابل توجهی بالاتر از S 1 هستند . آنها S 2 ، S 3 نامیده می شوندو غیره اینها چندین حالت فرعی نیز دارند. یک مولکول را می توان از حالت پایه خود به یکی از این حالت ها توسط یک فوتون با انرژی بالا منتقل کرد. سپس طیف جذب حداکثر محلی را در طول موج هایی با محتوای انرژی مربوطه نشان می دهد (شکل طیف را ببینید). با این حال، طیف فلورسانس ثابت می ماند، زیرا فوتون فلورسانس همیشه از پایین ترین حالت برانگیخته گسیل می شود (همچنین به بالا مراجعه کنید).

علاوه بر حالت های تک، حالت های سه گانه نیز وجود دارد . کمترین حالت سه گانه انرژی با T 1 (نمودار انرژی را ببینید)، انرژی های بالاتر به عنوان T 2 ، T 3 و غیره نشان داده می شود. انتقال از حالت تک به حالت سه گانه، عبور بین سیستمی نامیده می شود . در این انتقال، اسپین یک الکترون باید بچرخد و در نتیجه مجموعه‌ای از اسپین‌های الکترون جفت‌نشده ایجاد می‌شود. احتمال وقوع این اتفاق معمولاً اندک است، اما زمانی که مولکول در یکی از حالت های برانگیخته بالاتر، یعنی S2 قرار دارد، به طور قابل توجهی افزایش می یابد .یا بالاتر به منظور به حداقل رساندن احتمال انتقال به حالت های سه گانه، در صورت امکان از تحریک به S 2 یا بالاتر باید اجتناب شود، زیرا فلورسانس نمی تواند از حالت های سه گانه ایجاد شود و این حالت ها عمر طولانی دارند.

از حالت سه گانه، الکترون می تواند انرژی خود را به عنوان گرما از دست بدهد تا به حالت پایه برگردد، یا یک فوتون منتشر کند. این فوتون خیلی دیرتر از فلورسانس پس از برانگیختگی رخ می دهد، فسفرسانس است .

با این حال، فلوروکروم همچنین می تواند از حالت سه گانه، یعنی سفید کردن، از بین برود . بر خلاف حالت‌های تک تک برانگیخته، زمان ماندن در حالت سه‌گانه به‌طور قابل‌توجهی طولانی‌تر است، به این معنی که شانس بیشتری برای واکنش شیمیایی با سایر مولکول‌های محیط وجود دارد. اگر رنگ فلورسنت واکنش شیمیایی داشته باشد، محصول واکنش معمولاً فلورسنت نیست و رنگ سفید شده است. واکنش با اکسیژن مولکولی ، O 2 از اهمیت ویژه ای برخوردار است ، زیرا این حالت پایه سه گانه دارد و واکنش های سه گانه-سه گانه بسیار مؤثر انجام می شود.

بنابراین هنگامی که اکسیژن از آماده سازی خارج می شود، سفید شدن می تواند کاهش یابد. این را می توان با مواد به اصطلاح ضد محو شدن (به انگلیسی for anti-bleaching agents) که اثر کاهشی دارند، به دست آورد . آنتی اکسیدان ها به عنوان مثال پارا فنیل آمین دی آمین، DABCO یا گالات ها استفاده می شوند . با این حال، نمی توان به طور کامل از سفید شدن جلوگیری کرد. بنابراین مهم است که فلوروکروم‌هایی را برای برچسب فلورسنت انتخاب کنید که تا حد امکان پایدار باشند.

سمیت نوری

واکنش هایی که در بخش قبل توضیح داده شد در میکروسکوپ فلورسانس سلول ها یا اندام های زنده نیز رخ می دهد. نه تنها سفید شدن در اینجا اتفاق می‌افتد، بلکه گونه‌های فعال اکسیژن که در طی واکنش با اکسیژن تشکیل می‌شوند، می‌توانند در واکنش بعدی به اجزای سلولی آسیب برسانند و در نتیجه منجر به مرگ سلول شوند. در اینجا نیز افزودن مواد کاهنده می تواند کمک کننده باشد، مانند اسید اسکوربیک یا ترولوکس .

با این حال، نور موج کوتاه، به ویژه نور UV، می‌تواند مستقیماً بدون ایجاد فلورسانس به سلول‌ها آسیب برساند. این یک مشکل با طیف گسترده و منابع نور UV بالا مانند لامپ های بخار جیوه است . مولفه UV بالا منبع نور را نمی توان به طور کامل توسط فیلترها مسدود کرد. بنابراین استفاده از منابع نور بدون اشعه ماوراء بنفش مانند LED، لیزر یا لامپ های هالوژن برای مشاهدات زندگی مفید است.

هر دو مشکل کاهش می یابد اگر قرار گرفتن در معرض برای سوال مربوطه تا حد امکان پایین نگه داشته شود. دوربین‌های حساس یا ردیاب‌های دیگر نیز می‌توانند به این امر کمک کنند. در صورتی که میدان روشن، کنتراست فاز ، کنتراست تداخل دیفرانسیل یا روش های مشابه به جای فلورسانس برای مکان یابی و فوکوس ناحیه تصویر (سلول ها) استفاده شود، می توان تشکیل گونه های اکسیژن فعال را کاهش داد و در نتیجه بررسی میکروسکوپی فلورسانس به حداقل ممکن کاهش یافت.

علاوه بر اثرات فوتوتوکسیک ذکر شده، غلظت بیش از حد مواد مورد استفاده برای برچسب زدن فلورسنت می تواند منجر به مسمومیت مستقیم سلول ها شود.

تلاقی سیگنال ها به کانال های رنگی مجاور

هنگامی که سیگنالی در کانال رنگ مجاور دیده می شود، زمانی که چندین علامت وجود دارد، به عنوان bleedthrough یا crosstalk شناخته می شود. انتهای طول موج بلند طیف انتشار اکثر فلوئوروکروم ها به آرامی به صفر می رسد. به همین دلیل، تداخل اغلب با تحریک و تشخیص همزمان فلوئوروکروم‌های همسایه در طیف رخ می‌دهد، برای مثال یک فلوئوروکروم سبز در کانال نارنجی همسایه. اگر از فیلترهای باند باریک استفاده شود و/یا رنگ ها به جای همزمان تحریک شوند، می توان از این جلوگیری کرد یا حداقل کاهش داد.

آماده سازی و کاربرد میکروسکوپ فلورسانس در علوم زیستی

میکروسکوپ فلورسانس به روش های مختلفی در علوم زیستی استفاده می شود. برخی از اشیاء مورد بررسی به خودی خود فلورسنت هستند. به این اتوفلورسانس می گویند . به عنوان مثال، گیاهان دارای کلروفیل و رنگدانه های دیگری هستند که به طور طبیعی فلورسانس می کنند. با این حال، اتوفلورسانس اغلب نامطلوب است زیرا، به عنوان فلورسانس پس زمینه، تشخیص فلورسانس مصنوعی را دشوار می کند.

روش‌های مختلفی برای برچسب‌گذاری فلورسنت برای کاربردهای زیست‌پزشکی توسعه یافته‌اند. برخی از رنگ های فلورسنت به دلیل خواص شیمیایی خود مستقیماً به ساختار مورد بررسی متصل می شوند. این گروه شامل رنگ‌های DNA مانند DAPI ، آکریدین نارنجی و Hoechst 33342 یا رنگ‌های غشایی مانند نیل رد یا DiI است . برخی از این رنگ ها می توانند سلول های زنده را نیز لکه دار کنند. [15]

در موارد دیگر، یک مولکول غیر فلورسنت که به ساختار مورد نظر متصل می شود، از نظر شیمیایی با یک رنگ فلورسنت جفت می شود. نمونه‌هایی از این رویکرد عبارتند از ایمونوفلورسانس ، که از آنتی‌بادی‌های نشان‌دار شده با فلورسنت ، هیبریداسیون فلورسانس درجا ، تکنیکی برای تشخیص میکروسکوپی بخش‌های بزرگ‌تر DNA، یا رنگ‌آمیزی اکتین با فالویدین نشان‌دار شده با فلورسنت استفاده می‌کند . [15]

پروتئین ها را می توان به صورت ژنتیکی با یک پروتئین فلورسنت مانند GFP ترکیب کرد . از تصویر میکروسکوپی فلورسانس، می‌توان نتیجه‌گیری در مورد توزیع و آرایش پروتئین مورد بررسی در سلول زنده و معمولاً ثابت (به عنوان مثال در هسته سلول، در سیتوپلاسم، متصل به غشای سلول یا صادر شده به خارج ) یا سلول به دست آورد. اجزا را می توان با پروتئین های خاص آنها (مانند رشته های اکتین توسط اکتین یا میکروتوبول ها توسط توبولین ) مشاهده کرد.). فعل و انفعالات بین پروتئین ها را می توان هنگامی که با پروتئین های فلورسنت مختلف ترکیب می شوند مشاهده کرد. پروتئین های فلورسنت نیز می توانند تحت کنترل یک پروموتر خاص نوع سلول برای شناسایی انواع سلول های خاص بیان شوند. [16]

گروه دیگر پروب هایی هستند که رفتار فلورسانس آنها بسته به وضعیت محیط آنها تغییر می کند. رنگ‌های وابسته به کلسیم مانند aequorin ، fura-2 ، furaptra ، calcein و indo-1 می‌توانند نوسانات غلظت یون‌های کلسیم را در یک سلول نشان دهند. رنگ های وابسته به ولتاژ یا پروتئین های گزارشگر VSFP یا PROPS می توانند برای نشان دادن تغییرات ولتاژ در یک سلول استفاده شوند. با پروتئین های گزارشگر حساس به ردوکس مانند roGFP ، rxYFP یا HyPer ، پتانسیل های ردوکسپیگیری شود. نشانگرهای PH فلورسنت می توانند مقادیر مختلف pH را در یک سلول تجسم کنند . [17]

• میکروگراف های فلورسانس
• 

  سلول های اندوتلیال زیر میکروسکوپ فلورسانس. میکروتوبول ها سبز (با آنتی بادی نشاندار شده با FITC )، رشته های اکتین قرمز (با فالویدین – TRITC ) هستند. DNA موجود در هسته سلول با DAPI (آبی) رنگ آمیزی شد.

• 

  سلول های زنده HeLa در میکروسکوپ کانفوکال. میتوکندری به رنگ قرمز، هسته به رنگ آبی، میکروتوبول ها به رنگ سبز.

• 

  سلول در انتهای میتوز در تلوفاز . کروموزوم آبی (DAPI)، میکروتوبول قرمز، پروتئین INCENP به دلیل ادغام با GFP سبز رنگ می شود.

• 

  تصویر ایمونوفلورسانس در گانگلیون نخاعی موش صحرایی. دو پروتئین مختلف با نشانگرهای فلورسنت قرمز یا سبز رنگ آمیزی شدند.

• 

  کروموزوم های متافاز از یک لنفوسیت انسانی زن رنگ آمیزی شده با کرومایسین A3.

• 

  هسته سلولی فیبروبلاست موش ، قلمرو کروموزوم‌های 2 (قرمز) و 9 (سبز) با هیبریداسیون درجا فلورسانس رنگ‌آمیزی شدند. رنگ مقابل DNA به رنگ آبی.

• 

  سلول های HeLa، میتوکندری ها با GFP ذوب شده به یک پپتید سیگنال مناسب نشاندار می شوند.

• 

  سلول های مخمری که دارای دو پروتئین غشایی مختلف هستند که با GFP یا RFP (پروتئین فلورسنت قرمز) ترکیب شده اند. سلول های منفرد دارای مقادیر متفاوتی از این دو پروتئین و در نتیجه سایه های متفاوتی هستند.

کاربردها در علم مواد

برخلاف علوم زیستی، رنگ های فلورسنت به ندرت در علم مواد استفاده می شود . کاربرد میکروسکوپ فلورسانس عمدتاً محدود به مواردی است که ماده اتوفلورسنت است. به عنوان مثال، برخی از اجزای مواد کامپوزیتی فلورسنت هستند و می توان آنها را از سایر اجزای غیر فلورسنت تشخیص داد. فلورسانس را می توان با انعکاس در یک میکروسکوپ کانفوکال برای نمایش بهتر وضعیت ترکیب کرد . به عنوان مثال، این امکان را فراهم می کند تا بین بایندرهای فلورسنت (پلیمر پایه) و الیاف غیر فلورسنت در مواد کامپوزیتی تقویت شده با الیاف شیشه تمایز قائل شویم.

الیاف آلی در کاغذ ، چوب یا رافیا در تعدادی از مطالعات برای تعیین آرایش یا ترکیب آنها مورد بررسی قرار گرفته اند.

انواع مختلف سلول های خورشیدی را می توان با استفاده از میکروسکوپ فلورسانس نیز بررسی کرد. میکروسکوپ فلورسانس کانفوکال اغلب استفاده می شود، همچنین در ترکیب با میکروسکوپ بازتابی کانفوکال. در سلول های خورشیدی آلی ، از دست دادن اجزای آلی فلورسنت ناشی از اکسیداسیون با اکسیژن نفوذ یافته به سلول را می توان مطالعه کرد. به شرطی که محصولات تخریب فلورسنت نباشند. تأثیر نور بر تشکیل لایه پروسکایتی به همین نام در سلول های خورشیدی پروسکایت مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفت .

اگرچه تعدادی از کانی ها فلورسانس می کنند، میکروسکوپ فلورسانس در سنگ شناسی استفاده کمی دارد . یک استثنای قابل توجه مطالعات زغال سنگ و اجزای آلی در رسوبات است . مواد معدنی خالص عمدتا غیر فلورسنت هستند، اما فلورسانس می تواند توسط ناخالصی های معدنی یا آلی مختلف ایجاد شود . به این گونه اجزای سنگ ساز زغال سنگ که منشأ آلی دارند، ماسرال می گویند . یک زیر گروه لیپتینیت های غنی از چربی هستند . این اجزای فلورسنت به ویژه روی سطوح صیقلی به خوبی کار می کننداز نظر میکروسکوپی از اجزای غیرآلی غیر فلورسنت متمایز شود. خواص فلورسنت در طول تشکیل زغال سنگ تغییر می کند، به طوری که می توان مواد را از ذخایر مختلف تشخیص داد.

روش های ویژه میکروسکوپ فلورسانس

میکروسکوپ ورق نوری

در مورد میکروسکوپ ورق نوری ( میکروسکوپ ورق نوری انگلیسی ؛ همچنین میکروسکوپ نوری ورق یا میکروسکوپ روشنایی تک صفحه ای ، SPIM)، نور تحریک از کنار به عنوان یک صفحه نوری یا ورقه نوری تابش می شود . این کار را می توان با یک لنز دوم یا یک لنز استوانه ای مربوطه انجام داداتفاق می افتد که عمود بر عدسی مشاهده است و صفحه باریکی از نمونه را روشن می کند. فلورسانس فقط در این صفحه روشن ایجاد می شود و این صفحه در عدسی مشاهده متمرکز است. در سطوح دیگر، هیچ فلورسانس پس زمینه تاری ایجاد نمی شود، که منجر به کاهش کنتراست در میکروسکوپ فلورسانس معمولی می شود. این روش بهبود وضوح محوری یک میکروسکوپ فلورسانس معمولی را زمانی که ورقه نور نازک‌تر از عمق میدان هدف مشاهده است، ممکن می‌سازد. روشنایی جانبی جسم معاینه شبیه به ترتیب در اولترامیکروسکوپ شکافی است .

میکروسکوپ فلورسانس کانفوکال و دو فوتونی

با هر دو میکروسکوپ کانفوکال و دو فوتون، نمونه اسکن می شود: نور تحریک روی یک نقطه متمرکز می شود و فلورسانس از این نقطه به آشکارساز می رسد. نقطه بر روی نمونه حرکت می کند و شدت فلورسانس اندازه گیری شده در هر مورد با هم ترکیب می شود تا تصویری در یک کامپیوتر کنترلی تشکیل شود.

در میکروسکوپ فلورسانس کانفوکال، فلورسانس در مخروط روشنایی در بالا و پایین صفحه کانونی نیز رخ می دهد. با این حال، این به آشکارساز نمی رسد زیرا توسط یک سوراخ در صفحه تصویر میانی مسدود شده است . با مسدود کردن این فلورسانس پس‌زمینه، سیگنال در صفحه کانونی در برابر پس‌زمینه بهتر از میکروسکوپ فلورسانس کلاسیک خودنمایی می‌کند. با توجه به این تصاویر با کنتراست بسیار بالاتر، میکروسکوپ های کانفوکال به طور گسترده در تحقیقات بیولوژیکی استفاده می شوند.

یک رنگ فلورسنت نیز می تواند با جذب دو فوتون به جای جذب فوتون تحریک شود . لازمه این کار این است که این دو فوتون کم و بیش به طور همزمان به رنگ فلورسنت برسند و هر دو با هم محتوای انرژی مناسبی برای بالا بردن الکترون رنگ به سطح انرژی برانگیخته داشته باشند. هنگام استفاده از لیزر پالسی برای تحریک می توان هر دو شرط را برآورده کرداستفاده می شود که بسته به رنگ فلورسنتی که قرار است برانگیخته شود، طول موج هایی بین 700 تا 1200 نانومتر با شدت بالا ایجاد می کند و این نور از طریق عدسی روی نقطه ای متمرکز می شود. چگالی فوتون آنقدر زیاد است که احتمال برخورد همزمان دو فوتون به مولکول فلورسنت کافی وجود دارد. بر خلاف میکروسکوپ کانفوکال، که در آن حجم بازخوانی محدود است، در اینجا حجم تحریک محدود است. نور موج بلندتر عمق نفوذ بیشتری به بافت‌های بیولوژیکی دارد، زیرا جذب قوی‌تر و همچنین پراکندگی کمتری دارد .تبدیل می شود. بنابراین از میکروسکوپ فلورسانس دو فوتونی برای نفوذ عمیق‌تر به بافت نسبت به روش‌های دیگر استفاده می‌شود. این روش همراه با روش هایی که به فلورسانس متکی نیستند، میکروسکوپ چند فوتونی یا میکروسکوپ غیر خطی نامیده می شود.

طیف سنجی همبستگی فلورسانس

اگرچه طیف‌سنجی همبستگی فلورسانس (FCS ) یک روش میکروسکوپ فلورسانس است ، اما تصویری تولید نمی‌کند. در یک میکروسکوپ کانفوکال، لیزر تحریک بر روی نمونه اسکن نمی شود، بلکه در یک مکان پارک می شود. بنابراین حجم بسیار کمی در مدت زمان طولانی تری مشاهده می شود. اگر مولکول های فلورسنت به داخل یا خارج از این حجم حرکت کنند، روشنایی اندازه گیری شده تغییر می کند. از چنین مجموعه ای از اندازه گیری ها می توان به عنوان مثال برای تعیین سرعت انتشار مولکول ها در محلول استفاده کرد. از آنجایی که سرعت انتشار به اندازه بستگی دارد، در میان چیزهای دیگر، می توان بررسی کرد که آیا یک پروتئین نشاندار شده با فلورسنت به پروتئین دومی که در محلول نیز وجود دارد متصل می شود و بنابراین آهسته تر حرکت می کند.

رویه‌های وضوح پیشرفته

در میکروسکوپ، وضوح فاصله ای است که دو ساختار باید داشته باشند تا به عنوان ساختارهای جداگانه درک شوند. در قرن نوزدهم، ارنست آبه اولین کسی بود که فهمید این وضوح اساساً توسط پراش محدود می شود . بنابراین این حد به عنوان حد Abbe شناخته می شود. می توان آن را با استفاده از فرمول های مناسب به طور دقیق محاسبه کرد و برای میکروسکوپ های خوب در هنگام استفاده از غوطه وری در روغن و بسته به طول موج حدود 200 نانومتر است .

حد Abbe برای مدت طولانی غیرقابل عبور تلقی می شد. با این حال، از نیمه دوم قرن بیستم، برخی از روش‌های میکروسکوپی با وضوح بهتری نسبت به حد پیش‌بینی شده Abbe توسعه یافتند. قدیمی ترین این روش ها میکروسکوپ کانفوکال است (همچنین به بخش وضوح در مقاله میکروسکوپ کانفوکال مراجعه کنید). به دلایل عملی نیز نمی توان به این امر دست یافت.

در دهه 1980، میکروسکوپ TIRF ( میکروسکوپ فلورسانس بازتاب داخلی کل ) پیشنهاد شد. فقط رنگ های فلورسنت در نمونه که بسیار نزدیک به شیشه پوشش هستند با آن تحریک می شوند. اگر نمونه، به عنوان مثال سلول های زنده، در یک محیط آبی باشد، تحریک از لغزش پوششی تنها در لایه ای به ضخامت 100 تا 200 نانومتر نفوذ می کند. بنابراین ضخامت لایه به طور قابل توجهی کمتر از آن چیزی است که در میکروسکوپ معمولی به دلیل پراش ممکن است. این منجر به کنتراست بسیار بالاتری می شود، زیرا فقط مقدار کمی از مواد برای فلورسانس برانگیخته می شود. این شکل خاص از تحریک با روشن کردن نمونه با زاویه ای به اندازه کافی بزرگ به دست می آید که لبه پوشش رو به محیط آبی باشد.بازتاب کامل رخ می دهد و پرتو نور به هیچ وجه به نمونه نفوذ نمی کند. با این حال، یک موج ناپدید کننده در لبه رخ می دهد ، که می تواند منجر به تحریک شود، اما با افزایش فاصله از شیشه پوشش، خیلی سریع ضعیف می شود.

در حالی که “رزولوشن” طبق تعریف حداقل فاصله بین دو ساختار است، می توان موقعیت دقیق یک جسم را بسیار دقیق اندازه گیری کرد. بنابراین، با میکروسکوپ فلورسانس، حد Abbe را می توان با تعیین موقعیت دقیق اجسام در کانال های رنگی مختلف و سپس اندازه گیری فاصله بین آنها دور زد. این تکنیک در دهه 1990 توسعه یافت و بعدها به عنوان میکروسکوپ طیفی با فاصله دقیق (SPDM) شناخته شد. می توان از آن برای اندازه گیری فواصل از ساختارهای فلورسنت کوچک با دقت تا حدود 70 نانومتر استفاده کرد. با این حال، به بهبود کلی در وضوح منجر نمی شود، زیرا هر یک از کانال های رنگی ضبط شده در معرض پراش هستند. [28] [29]

با این حال، در پایان قرن بیستم و آغاز قرن بیست و یکم، برخی از روش ها توسعه یافته اند که امکان بهبود کلی را فراهم می کند. آنها در مجموع به عنوان میکروسکوپ فوق رزولوشن ، گاهی اوقات نانوسکوپی نامیده می شوند . وجه مشترک همه آنها این است که بر اساس میکروسکوپ فلورسانس ساخته شده اند. سه تا از این تکنیک‌ها تا حدی مقبولیت پیدا کرده‌اند و به صورت تجاری در دسترس هستند: STED، روشن‌سازی ساختاری، و میکروسکوپ محلی‌سازی. علاوه بر این، روش‌های دیگری نیز وجود دارد که نتوانسته‌اند در برابر موارد ذکر شده مقاومت کنند یا تاکنون تنها توسط گروه‌های فردی مورد استفاده قرار گرفته‌اند. برخی از روش ها به دلیل ویژگی های رایج به عنوان میکروسکوپ RESOLFT خلاصه می شوند.

میکروسکوپ فلورسانس با وضوح بالا در سال 2008 توسط مجله Nature Methods به عنوان روش سال انتخاب شد. ویلیام مورنر ، اریک بتزیگ و استفان هل جایزه نوبل شیمی سال 2014 را برای توسعه برخی از این روش‌ها دریافت کردند .

میکروسکوپ STED

در میکروسکوپ STED ( تخلیه انتشار تحریک شده انگلیسی ) به وضوح از حد پراش غلبه می شود. برانگیختگی حجم محدود پراش در نمونه با تحریک زدایی حلقه ای شکل توسط نور با طول موج بلندتر دنبال می شود. مولکول های برانگیخته در ناحیه تحریک زدایی از طریق انتشار تحریک شده به حالت پایه باز می گردند . در نتیجه، حجم ساطع کننده فلورسانس به طور قابل توجهی کاهش می یابد و وضوح میکروسکوپ افزایش می یابد. [31] [24]

روشنایی ساختار یافته [ ویرایش | ویرایش منبع ]

با روشنایی ساختاریافته یا میکروسکوپ سیم کارت سه بعدی ( میکروسکوپ روشنایی ساختاری انگلیسی ) همه فلوروکروم ها هیجان زده نمی شوند، بلکه تنها بخشی از آماده سازی به شکل یک “ساختار” خاص، یک الگوی راه راه است. هنگامی که الگوی روشنایی شناخته شده بر روی توزیع فلوئوروکروم ناشناخته در نمونه قرار می گیرد، اثرات موآر رخ می دهد که اندازه آنها بالاتر از حد تفکیک است، حتی اگر ساختار مجهول کوچکتر باشد. با جابجایی و چرخاندن الگوی روشنایی، می توان با محاسبه کامپیوتری با استفاده از اطلاعات اضافی از الگوهای موآر تصاویر مربوطه، یک تصویر نهایی با وضوح تا دو برابر بیشتر تولید کرد. [32]

میکروسکوپ محلی سازی [ ویرایش | ویرایش منبع ]

فرآیندهای میکروسکوپی بر اساس یک اصل اساسی مشترک به عنوان میکروسکوپ محلی سازی خلاصه می شوند: در حالی که در میکروسکوپ فلورسانس کلاسیک همه فلوروکروم ها به طور همزمان برانگیخته می شوند، در اینجا آنها یکی پس از دیگری برانگیخته می شوند به طوری که فقط بخش کوچکی از آنها روشن می شود . بسیاری از تصاویر یکی پس از دیگری از یک صفحه کانونی گرفته می شوند، اغلب بیش از هزار. اکنون در هر یک از این تصاویر، موقعیت دقیق فلوئوروکروم های درخشان مشخص شده و این موقعیت به تصویر نهایی منتقل می شود. فرآیندها در نحوه روشن و خاموش شدن مولکول‌های رنگ جداگانه، یعنی «چک زدن» متفاوت است.

میکروسکوپ محلی‌سازی فعال‌شده نوری (PALM) بر اساس انواع پروتئین فلورسنت سبز است که می‌تواند با نور با طول موج‌های خاص روشن و خاموش شود. STORM و dSTORM از رنگ های فلورسنت مناسب استفاده می کنند که به ندرت در محلول های بافر خاصی فلورسانس می کنند. تخلیه حالت زمین (GSD) بر این واقعیت استوار است که در هر نقطه از زمان اکثر فلوروکروم ها در حالت سه گانه غیر فلورسنت هستند که می تواند توسط تحریک نور قوی ایجاد شود. رنگ DNA مبتنی بر اتصال موقت مولکول های DNA کوتاه و تک رشته ای به مولکول های هدف مکمل است. [24]

سایر تکنیک های افزایش وضوح [ ویرایش | ویرایش منبع ]

میکروسکوپ 4Pi اولین تکنیک فوق رزولوشن تجاری در دسترس بود، اما امروزه دیگر در دسترس نیست. [24] تکنیک دیگر Vertico-SMI است که در هایدلبرگ توسعه یافت.

میکروسکوپ طول عمر فلورسانس (FLIM) [ ویرایش | ویرایش منبع ]

پس از تحریک، یک فلورسر برای مدت کوتاهی در حالت برانگیخته باقی می‌ماند تا نور فلورسنت ساطع کند. مدت زمان این بازه زمانی در محدوده مشخصی برای یک ماده خاص متفاوت است، به طوری که می توان میانگین طول عمر فلورسانس را برای یک ماده مربوطه تعیین کرد. در محدوده نانوثانیه است، برای مثال 3.25 ns برای فلورسئین، 3.41 ns برای تگزاس رد و 1.1 ns برای ائوزین. اگر فلورسانس در نمونه میکروسکوپی با لیزر پالسی یا مدوله شده برانگیخته شود و از آشکارسازهای ویژه استفاده شود، می توان از روش های اندازه گیری ویژه استفاده کرد.تعیین زمانی که پس از آن فلورسانس به آشکارساز می رسد. بنابراین، رنگ های فلورسنت را نه تنها می توان از طریق رنگ، بلکه بر اساس طول عمرشان از یکدیگر متمایز کرد. این در میکروسکوپ تصویربرداری طول عمر فلورسانس ( FLIM) استفاده می شود. لیزرهای پالسی و مدوله شده در محدوده طول موج مرئی برای تحریک با فوتون وجود دارد. با این حال، FLIM را می توان در ترکیب با تحریک چند فوتونی نیز استفاده کرد (به بالا مراجعه کنید)، که به هر حال برای آن لیزرهای پالسی مورد نیاز است. [33] [34]

انتقال انرژی تشدید فورستر (FRET) [ ویرایش | ویرایش منبع ]

در انتقال انرژی رزونانس فورستر (گاهی اوقات نیز: انتقال انرژی رزونانس فلورسانس)، انرژی یک رنگ فلورسنت برانگیخته، دهنده، توسط فلورسانس آزاد نمی شود، بلکه مستقیماً به رنگ فلورسنت دیگری (گیرنده) منتقل می شود. این امر در صورتی امکان پذیر است که اولاً بین دهنده و گیرنده کمتر از 10 نانومتر فاصله داشته باشند و ثانیاً انرژی انتشار دهنده با انرژی تحریک پذیرنده مطابقت داشته باشد. بنابراین، طیف انتشار دهنده باید با طیف تحریک پذیرنده همپوشانی داشته باشد. به عنوان مثال، یک رنگ فلورسنت سبز می تواند به عنوان اهدا کننده برای گیرنده فلورسنت نارنجی عمل کند. مثال دیگر پروتئین فلورسنت فیروزه ای CFP به عنوان اهدا کننده پروتئین فلورسنت زرد YFP است. [35]

اگر FRET رخ دهد، با وجود تحریک، هیچ فلورسانسی از اهداکننده منتشر نمی‌شود، در عوض، فلورسانس گیرنده را می‌توان مشاهده کرد. راندمان FRET با قدرت ششم فاصله بین دهنده و گیرنده کاهش می یابد. بنابراین وقوع FRET نزدیکی این دو را نشان می دهد، با دقت بسیار پایین تر از حد وضوح. [35]

بلیچینگ عمدی برای اندازه گیری انتشار (FRAP و FLIP)

در FRAP ( بازیابی فلورسانس پس از سفید کردن نور )، یک مولکول دارای برچسب فلورسانس در یک سلول زنده عمداً در بخشی از سلول با قرار گرفتن در معرض نور قوی، معمولاً توسط پرتو لیزر متمرکز، به طور عمدی در بخشی از سلول سفید می شود. سپس مشاهده می شود که مولکول ها با چه سرعتی از قسمت سفید نشده سلول به قسمت سفید شده باز می گردند. نتیجه گیری در مورد رفتار اتصال مولکول را می توان از سرعت انتشار تعیین شده استخراج کرد. [36]

از طرف دیگر با FLIP ( از دست دادن فلورسانس در فوتوبلیچینگ )، یک ناحیه از سلول به طور مداوم سفید می شود. مشاهده می شود که فلورسانس با چه سرعتی در قسمت سفید نشده سلول کاهش می یابد. [36]

تاریخچه

1904: کشف کوهلر [ ویرایش | ویرایش منبع ]

اولین مشاهدات میکروسکوپی فلورسانس تصادفی و آزاردهنده بود. آگوست کوهلر ، کارمند سازنده میکروسکوپ کارل زایس ، می خواست وضوح میکروسکوپ نوری را افزایش دهد. وضوح به طول موج بستگی دارد، بنابراین او یک میکروسکوپ برای نور UV ساخت تا از طول موج کوتاهتر آن استفاده کند. اگرچه تصویری که به این ترتیب تولید می شود برای چشم انسان قابل مشاهده نبود، اما می توان آن را به صورت عکاسی گرفت. با انجام این کار، او متوجه شد که

بنابراین کوهلر در اوایل متوجه شد که فلورسانس که با میکروسکوپ UV تداخل می کند می تواند کاربردهای مفیدی را نیز فعال کند.

1910-1913: اولین میکروسکوپ های فلورسانس و کاربردها [ ویرایش | ویرایش منبع ]

اولین میکروسکوپ فلورسانس تجاری موجود توسط Oskar Heimstädt که ریاست دفتر محاسبات و طراحی در کارخانه سازنده میکروسکوپ وین کارل ریچرت را بر عهده داشت، ساخته شد . آن را شخصاً رایچرت در سال 1911 در نشست دانشمندان و پزشکان طبیعی آلمان ارائه کرد . در همان سال، هایمشت مقاله ای با عنوان «میکروسکوپ فلورسانس» در مجله میکروسکوپی علمی منتشر کرد. [37] [38]

نور فرابنفش برای تحریک فلورسانس به خوبی مناسب بود زیرا برای چشم قابل مشاهده نبود و بنابراین نیازی به فیلتر مسدود کننده نبود. تحریک خوب مستلزم آن بود که هیچ نور مرئی از منبع نور به نمونه نرسد، اما تا آنجا که ممکن است نور UV. یک فیلتر تحریک مناسب اندکی قبل، در سال 1910، توسط هانس لمان در Zeiss ساخته شده بود. این شامل یک کووت فیلتر بود که از دو محفظه در امتداد محور نوری تشکیل شده بود. سه دیواره از Jenaer Blau- Uviolglas ساخته شده بود، یک محفظه با محلول مس اشباع سولفات پر شده بود ، و دیگری با محلول نیتروزودیمی متیل آنیلین رقیق شده بود. نور تحریکی که به این روش تولید می‌شود، «فرابنفش فیلتر شده» نامیده می‌شود. [39]از آنجایی که شیشه معمولی نور ماوراء بنفش را جذب می کند، به زودی از یک کندانسور کوارتز برای به دست آوردن سطوح بالایی از روشنایی استفاده شد. با این حال، یک مشکل جدید بوجود آمد: لنزهای شیشه ای در لنز شروع به فلورسانس کردند. بنابراین Lehmann از یک خازن میدان تاریک استفاده کرد : نور برانگیختگی به گذشته هدایت شد و نور مرئی باقیمانده از منبع نور در تصویر میکروسکوپی نیز اجتناب شد. [37] [38]

Heimstädt در مورد احتمالات و چشم اندازهای آینده میکروسکوپ فلورسانس نوشت.

همچنین در سال 1911، فلورسانس کلروپلاست ها توسط Michail Tswett توصیف شد . [40] استانیسلاوس فون پروازک در سال 1913 اولین اثری را منتشر کرد که در آن از رنگ های فلورسنت استفاده شد، یعنی ائوزین و قرمز خنثی . [41]

یک سال پس از میکروسکوپ فلورسانس رایچرت، “میکروسکوپ لومینسانس” زایس که توسط Lehmann ساخته شد در نشست دانشمندان و پزشکان طبیعی آلمان در سال 1912 ارائه شد. روشنایی میدان تاریک منجر به کاهش دیافراگم عددی و در نتیجه کاهش وضوح می شود. بنابراین، Lehmann بر روشنایی میدان روشن معمولی با نور UV تکیه کرد. برای جلوگیری از ورود اشعه ماوراء بنفش به چشم، او از یک فیلتر شیشه ای مسدود کننده اشعه ماوراء بنفش ساخته شده از شیشه Euphos استفاده کرد که به عنوان یک پوشش روکش استفاده می شد . فیلتر باید بین نمونه و هدف قرار می گرفت تا از تحریک فلورسانس در شیء جلوگیری شود، بنابراین هیچ موقعیت دیگری برای فیلتر ممکن نبود. کندانسور دارای لنزهای کوارتز بود که از لام های شیشه ای استفاده می شدبرای اطمینان از انتقال UV از کریستال سنگ ساخته شده بودند . بزرگنمایی استاندارد توصیه شده 62× بود (از جمله بزرگنمایی چشمی)، نباید از 300× تجاوز کرد. تجهیزات فلورسانس اضافی، یعنی بدون میکروسکوپ واقعی، با ارزان ترین منبع نور تحریک، یک لامپ قوس قابل تنظیم دستی، حدود 500 مارک قیمت دارند . به این مقدار 4.50 متر برای یک اسلاید کریستال سنگی 30×25 میلی متر ضخامت 0.5 میلی متر و یک علامت در هر لغزش پوششی Euphosglas اضافه شد. علاوه بر عکس‌های سیاه و سفید، تصاویر رنگی نیز می‌توانند با استفاده از فرآیند اتوکروم ایجاد شوند . [37]

1933-1940: ماکس هایتینگر و فلوروکرومینگ [ ویرایش | ویرایش منبع ]

در روزهای اولیه میکروسکوپ فلورسانس، اجسام اتوفلورسنت تقریبا به طور انحصاری مشاهده می شدند. همچنین مکس هایتینگر ، در ابتدا یک محقق خصوصی در Weidling در نزدیکی وین، سپس در دانشگاه وین، شروع به مطالعه فلورسانس شراب و شراب میوه کرد. با این حال، از سال 1933، او رنگ های فلورسنت را تولید کرد که آنها را “فلوروکروم” نامید. او اصطلاحات فلورسانس ثانویه را برای سیگنال هایی که باید تولید شود و فلورسانس اولیه برای سیگنال هایی که در خود آماده سازی وجود دارد، ارائه کرد. او همچنین اصطلاح فلوروکروم را برای رنگ فلورسنت معرفی کرد. او ابتدا از عصاره های گیاهی به عنوان فلوئوروکروم و بعداً از یک سری مواد شیمیایی استفاده کرد. این کار او را قادر ساخت تا بخش های نازکی از بافت حیوانی و انسانی را رنگ آمیزی کند، به طوری که بافت شناسان نیز به میکروسکوپ فلورسانس علاقه مند شدند. از آنجایی که فقط غلظت های بسیار پایین فلوئوروکروم ها مورد نیاز بود، لکه های زنده نیز امکان پذیر بود که عمدتاً در گیاه شناسی استفاده می شد. با Auramine Oموفق به رنگ آمیزی باکتری سل شد. چندین رنگ آمیزی نیز امکان پذیر بود. هایتینگر اولین رساله را در سال 1934 منتشر کرد، کتاب او “میکروسکوپ فلورسانس – کاربرد آن در بافت شناسی و شیمی” در سال 1938 منتشر شد. [37] [39] [42]

هایتینگر برای بهبود میکروسکوپ فلورسانس خود با شرکت Reichert همکاری نزدیک داشت. مدل جدید “کام اف” از سال 1931 فروخته شد. این همچنین دارای یک لامپ قوس با الکترودهای آهن به عنوان منبع نور بود، زیرا دارای یک جزء UV نسبتاً بالا بین 300 نانومتر و 400 نانومتر بود. با این وجود، او به زمان نوردهی تا 20 دقیقه برای عکس هایش نیاز داشت. برای بزرگنمایی های کم، زمان نوردهی با لامپ های قوس کربنی را از یک تا ده دقیقه ذکر می کند. محلول nitrosyldimethylaniline در کووت فیلتر تحریک را می توان با فیلترهای شیشه ای سیاه حاوی اکسید نیکل جایگزین کرد. محلول سولفات مس، که جزء قرمز باقیمانده را در نور تحریک فیلتر می کرد، تنها در اوایل دهه 1940 با فیلترهای شیشه ای آبی جایگزین شد. روشنایی توسط یک کندانسور میدان روشن با شیشه معمولی بود. نشان داده شده است که شیشه کوارتز برای این مورد نیاز نیست. نور تحریک باقی مانده در چشمی با نصب فیلتر مسدود کننده شیشه ای زرد به ضخامت 1 میلی متر مسدود شد. در صورت نیاز به فیلتر مسدود کننده شفاف، می توان به جای آن از یک کووت با لایه 5 میلی متری محلول نیتریت سدیم استفاده کرد. به لطف فیلتر مسدود کننده زرد، لام های روکش ساخته شده از شیشه یوفوس دیگر ضروری نبودند و اسلایدهای معمولی نیز مناسب بودند. این به طور قابل توجهی هزینه های جاری را کاهش داد. به لطف فیلتر مسدود کننده زرد، لام های روکش ساخته شده از شیشه یوفوس دیگر ضروری نبودند و اسلایدهای معمولی نیز مناسب بودند. این به طور قابل توجهی هزینه های جاری را کاهش داد. به لطف فیلتر مسدود کننده زرد، لام های روکش ساخته شده از شیشه یوفوس دیگر ضروری نبودند و اسلایدهای معمولی نیز مناسب بودند. این به طور قابل توجهی هزینه های جاری را کاهش داد.[37] [42]

هایتینگر در کتاب خود از سال 1938 همچنین روشنایی نور فرودی را برای میکروسکوپ فلورسانس اجسام مات (Epicondensor از Zeiss-Jena، Epilum از Optical Works C. Reichert-Wien (نگاه کنید به طراحی شماتیک)، Ultropak از E. Leitz- Wetzlar و E. Busch-Rathenow ). با این حال، آنها با تحریک فلورسانس نور بازتابی امروزی با استفاده از شکاف پرتو دو رنگ قابل مقایسه نیستند. او به عنوان نمونه‌ای از کاربرد، بررسی مواد غذایی، داروها و رنگ‌ها و همچنین بررسی‌های اولیه فرآورده‌هایی را که قرار است بخش‌های نازکی از آنها تولید شود، ذکر می‌کند. او نور منعکس شده را برای مطالعات روی حیوانات زنده به عنوان “به ویژه ارزشمند” توصیف می کند.

در حدود سال 1940، Osram لامپ‌های جیوه‌ای پرفشار را وارد بازار کرد که برای آن‌ها Zeiss و Reichert (Lux UV و Lux UW) تجهیزات روشنایی (Lux UV و Lux UW) را توسعه دادند . این لامپ‌ها علاوه بر مدیریت ساده‌تر و روشنایی بیشتر، نه تنها خطوط منفرد را ساطع می‌کنند، بلکه یک طیف پیوسته را منتشر می‌کنند که با آن می‌توان همه مواد فلورسنت را برانگیخت. همچنین، آنها بخارهای ناخوشایند مانند لامپ های قوس آهنی تولید نمی کردند. لامپ های مشابه امروزه هنوز مورد استفاده قرار می گیرند. [37] [39] [43]

در دهه 1940، از فیلم های اسلاید رنگی برای مستندسازی استفاده شد. با وجود همه پیشرفت‌ها، زمان‌های نوردهی عمدتاً هنوز در محدوده دو رقمی دقیقه بود. [37]

1942-1958: توسعه ایمونوفلورسانس و فلورسانس رنگهای معمولی [ ویرایش | ویرایش منبع ]

یک پیشرفت برای میکروسکوپ فلورسانس، معرفی ایمونوفلورسانس بود . در سال 1942 آلبرت هیوت کونز و همکارانش جفت شدن ایزوسیانات فلورسئین با آنتی بادی ها را منتشر کردند . با فلورسانس سبز روشن خود، این فلوئوروکروم در برابر اتوفلورسانس مایل به آبی بسیاری از بافت ها نسبت به ایزوسیانات آنتراسن که قبلاً آزمایش شده بود، بهتر ظاهر شد . آنتی‌بادی‌ها علیه پنوموکوک‌ها هدایت شدند که می‌توان با استفاده از میکروسکوپ فلورسانس در بافت موش شناسایی کرد. [44] با این حال، جفت کردن آنتی بادی ها از نظر فنی چالش برانگیز بود و مزدوج ها ناپایدار بودند. [37]

زیگفرید استراگر دریافت که برخی از رنگهای معمولی معروف مانند قرمز خنثی و رودامین B نیز فلورسانس می کنند . او همچنین نارنجی آکریدین را به میکروسکوپ فلورسانس معرفی کرد. او در کتابی در سال 1949 به جزئیات احتمالات برانگیختگی فلورسانس با نور آبی به جای UV را توضیح داد. استراگر از نور منعکس شده برای ردیابی جریان آب در گیاهان استفاده کرد. [37]

بهبود قابل توجهی در ایمونوفلورسانس در سال 1958 توسط JL Riggs و همکارانش با استفاده از ایزوتیوسیانات ها به جای ایزوسیانات ها به دست آمد. در این بین، کارگروه دیگری با استفاده از فلورسین ایزوسیانات فلورسین و ایزوسیانات رودامین B فلورسنت نارنجی موفق به تشخیص دو رنگ شده بود. ریگز و همکارانش اکنون موفق شده اند آنتی بادی ها را با ایزوتیوسیانات فلورسین بسیار پایدارتر (FITC) و رودامین B ایزوتیوسیانات برچسب گذاری کنند. [45] [37]

1962–1972: Johan Sebastiaan Ploem و معرفی فیلترهای تداخل [ ویرایش | ویرایش منبع ]

در دهه 1950، میکروسکوپ فلورسانس منحصراً با نور تحریکی UV، بنفش یا آبی انجام شد. [46] [47] این تنها با معرفی فیلترهای تداخلی که توسط Johan Sebastian Ploem هلندی در دهه 1960 تبلیغ شد، تغییر کرد. اولین کسانی که از شکاف دهنده پرتو دو رنگی در میکروسکوپ استفاده کردند، برومبرگ و کریلوا روسی در سال 1953 بودند .

با ایجاد آنتی بادی های متعدد برای ایمونوفلورسانس، نیاز به فلوئوروکروم با رنگ های مختلف بوجود آمد. با این حال، استفاده معمولی با نور UV اغلب تحریک آنها را دشوار می کند. در حدود سال 1962، Ploem شروع به همکاری با آثار Schott در ماینتس برای توسعه پرتوهای تقسیم‌کننده دو رنگ که نور آبی یا سبز را منعکس می‌کردند، کرد. Schott قبلاً بسیاری از فیلترهای شیشه ای را که معمولاً در میکروسکوپ فلورسانس استفاده می شود تولید کرده بود. شرکت لایتز Ploem را با یک اپی روشن کننده مات با یک آینه نیمه شفاف و مستقل از رنگ عرضه کرد. این در دانشگاه ون آمستردام بودبازطراحی شد و یک نوار لغزنده چهار حالته برای پرتوهای پرتوهای دو رنگی تحریک UV، بنفش، آبی و سبز در نظر گرفت تا بتوان طول موج تحریک مربوطه را به راحتی انتخاب کرد. برای اولین بار، برانگیختگی از طریق عدسی انجام شد، همانطور که امروزه معمول است. با انتخاب فیلترهای تداخل باند باریک برای نور تحریک آبی و سبز، رنگ‌های FITC (فلورسنت سبز) و تترمتیل رودامین ایزوتیوسیانات (TRITC؛ فلورسنت نارنجی) که معمولاً در ایمونوفلورسانس استفاده می‌شوند، می‌توانند نزدیک به حداکثر جذب خود بدون افزایش هم‌زمان افزایش مقدار جذب شوند. طول موج های تحریک اضافی باعث تحریک Ploem نتایج خود را در چندین مقاله از سال 1965 منتشر کرد. [37] [49]

لایتز سپس PLOEMOPAK را توسعه داد، دستگاهی که بر روی آن می‌توان چهار جداکننده پرتو را با چرخش به طور متناوب در مسیر پرتو قرار داد. نسخه‌های بعدی با فیلترهای مسدودکننده و فیلترهای تحریک تکمیل شدند تا اینکه سرانجام، در حدود سال 1972، نسخه‌ای به بازار آمد که شامل چهار مکعب فیلتر فلورسانس بود که هر کدام دارای یک فیلتر تحریک، تقسیم‌کننده پرتو و فیلتر مسدودکننده بود. مکعب ها را می توان توسط کاربر تعویض کرد تا با فلوئوروکروم های مورد استفاده مطابقت داشته باشد. [49]

این اساساً توسعه میکروسکوپ اپی فلورسانس را تکمیل کرد، همانطور که هنوز هم استفاده می شود. با این حال، چندین سال طول می کشد تا این نوع ساختمان به طور کلی پذیرفته شود. کتاب‌های درسی میکروسکوپ بریتانیا در سال‌های 1975 و 1977 فقط به امکان تحریک UV و نور عبوری اشاره می‌کنند. [50] [51] یکی دیگر از سال 1982 بیان کرد که روشنایی معمولا با یک کندانسور میدان تاریک انجام می شود، اما همچنین روشنایی نور منعکس شده را با یک تقسیم کننده پرتو دو رنگی توصیف کرد و این را به عنوان حساس تر به نور معرفی کرد. امکان تشخیص متوالی فلوئوروکروم هایی مانند FITC و رودامین با تعویض کلیه فیلترها نیز ذکر شد. [52]

یک کتاب درسی آلمان غربی در سال 1985 هر سه احتمال را توصیف کرد، نور عبوری روشن و میدان تاریک و برانگیختن میدان روشن با نور بازتابی از طریق شیئی، و دومی را به تنظیم بسیار ساده (از آنجایی که نیازی به کندانسور نیست) و شدت تحریک بالا با کنتراست عالی نسبت داد. به امکان تبادل سریع بلوک های فیلتر اشاره کرد. Leitz، Olympus ، Reichert، Zeiss و Jena به عنوان سازندگان این گونه سیستم ها نام برده شدند که احتمالاً به معنای VEB Carl Zeiss Jena بوده است. [53] یک کتاب درسی از سال 1988 به روش‌های قدیمی‌تر اشاره کرد، اما سپس بیان کرد: «میکروسکوپ‌های فلورسانس مدرن بر اساس اصل برانگیختگی میدان روشن نور بازتابی کار می‌کنند» با یک صفحه تقسیم‌کننده دو رنگ. همچنین گفت: “بیشتر تولیدکنندگان میکروسکوپ تجهیزاتی را برای میکروسکوپ فلورسانس نور عبوری و نور منعکس شده ارائه می دهند.” [54]